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RNAscope在**领域的应用 | Nature Cell Science发表文章举例之一

发布时间:2020-12-03

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对于**及**免疫的研究,近年来出现一些对于特异性抗体应用的挑战,像GPCR、点突变以及高度同源序列翻译产物的检测都因无法生成有效抗体从而无法在蛋白水平进行原位检测;与此同时对于转录水平的外显子跳跃,以及分泌型蛋白的检测由于抗体检测无法实现,或者分泌蛋白一旦合成则离开原始分泌细胞导致检出失真,导致需要在常规的DNA FISH以及蛋白免疫组化(IHC)方法外,采用RNA原位检测定位,从而对RNA的空间定位进行分析,以达到不同的科研检测目的。本文为使用近年来出现的新一代RNA原位检测技术——RNAscope及Basescope技术,在**领域进行原位追踪发表在Nature, Cell, Science文章的举例丛文。本期将聚焦2018年发表的2篇该类文章,了解国际大咖如何在**领域研究中,使用到该技术,并解决哪些问题。


文章举例一

2018年Biehs课题组在Nature上发表了基底细胞*(BCC)存活机制的研究[1],并指出Hh和Wnt途径的靶向**可能是防止残留BCC的有效方法。Erivedge(vismodegib)是一种批准用于基底细胞*(BCC)的**药物。尽管vismodegib具有很强的抗**活性,但**后仍残留有**细胞。研究人员发现这些残留的**并非发生了基因突变而产生耐药,而是通过Wnt通路重新编程驱动重要转录因子表达的增强子,从而使得BCC细胞存活。因此,Biehs等人认为Hh和Wnt途径的靶向**可能是防止残留BCC的有效方法。
尽管Hedgehog通路**剂在**BCC中有效,但某些患者中残留疾病仍然存在,并且在中断**后有可能促进复发。在文章中,为了研究**剂vismodegib对****的作用,Biehs等人使用了Btc3的Ptch1-Trp53小鼠模型,发现用vismodegib**的小鼠具有残留的BCC**,这些**会在停止**后快速再生。此时残留的BCC会启动类似小泡间表皮和峡部干细胞的转录程序。这一过程伴随着快速的Wnt途径活化和超级增强子的重新编程,以驱动关键转录因子的活化。因此,用vismodegib和Wnt途径**剂**BCC可以有效减少残余的**细胞存活。
在vismodegib**后,由于缺乏有效抗体,Biehs等人使用了RNAscope ISH对**中BCC细胞进行甄别。

vismodegib处理的BCC从膨大细胞(RNAscope检测到的Lhx2 mRNA,上图c和f,红色信号点)向小泡间表皮/峡部细胞转化(RNAscope检测到的DefB6 mRNA,上图j和k,红色信号点)。

由于BCC形成过程中需要Wnt信号,故Biehs等人使用RNAscope ISH分析Axin2表达水平与Wif1(Wnt信号的有效分泌**剂)表达水平的关系。结果显示Axin2表达水平与Wif1水平成反比,提示vismodegib与Wnt**剂联合使用可降低残留BCC**的发生率。**Biehs等人用Hh**剂(vismodegib)联合Wnt**剂(抗LRP6)**BCC**可减少Wnt信号传导并减少残留**。


文章举例二

2018年Apicella等人在Cell Metab上发表了一篇文章[2],针对*细胞乳酸分泌增加,可维持MET和EGFR靶向疗法的非细胞自主适应性耐药进行研究。**基质在维持耐药性中具有重要作用,基质分泌的生长因子HGF(肝细胞生长因子)可以在*细胞中**MET受体信号通路。MET**可以补偿由于**靶向药物**时引发的**细胞其他(例如EGFR)信号**。但是人们对于*细胞是否以及如何指示其微环境**HGF分泌,并介导耐药性了解甚少。Apicella等人研究发现,在长期使用酪氨酸激酶**剂(TKIs)的**下,EGFR或MET依赖的*细胞出现糖酵解和乳酸生成增加的代谢转变。进一步研究证实分泌的乳酸是指导**相关的成纤维细胞以核因子kB依赖性方式产生肝细胞生长因子(HGF)的关键分子。HGF增加,作用于其靶向受体MET,***细胞信号传导,持续抵抗TKIs。涉及乳酸分泌途径的靶向**药物可以消除EGFR耐药性,证明了该代谢产物在适应性过程中的关键作用。
Apicella等人用特异的抗MET TKI化合物(JNJ-605)**带有EBC1(MET依赖的NSCLC细胞系)异种移植瘤的小鼠,直至产生耐药性。(称为“RES-J”**)
并通过RNAscope ISH证实了适应性耐药细胞和**中基质Hgf表达的增加(由于HGF属于分泌型因子,蛋白水平很难在原位定位分泌该蛋白的细胞类型。而RNAscope由于检测的是HGF的mRNA,可以明确检测到该分泌蛋白的所在原始细胞)。在对乳酸/ HGF轴的**是否增强了对TKI的临床抵抗力的研究中,Apicella等人选取了6例基础性和耐药性的EGFR TKIs的NSCLC患者,从中获得配对的FFPE**样本,通过RNAscope ISH-IHC共染,证实6例患者样本中有3例间质HGF表达增加。


RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品,在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比,RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术,其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端,配以自身级联放大检测原理,可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下:

应用** 

使用RNAscope技术,靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列,即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种,所有组织以及所有基因的检测。

特异性强

RNAscope独特的双Z(ZZ) 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合,同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点,并会在杂交过程中被洗脱掉,从而防止非特异性信号的放大,使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。

灵敏度高

RNAscope方法检测每个RNA 分子时,只需三对双Z(ZZ)探针即可完成杂交和信号的可视化。

单分子可视化和单细胞定量

使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA,而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针,因而即使目标RNA发生部分降解,仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。

检测结果稳定一致性

RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成,且该技术针对不同样本类型(冰冻切片, 石蜡切片,悬浮细胞,贴壁细胞等)已经有成熟的实验操作流程,故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外,该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行,为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

多通道多靶点同时检测

由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大,故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点;而在荧光检测过程中,可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。



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