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RNA原位检测在骨和软骨样本制备处理技术浅谈及应用

发布时间:2020-12-25

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作为新一代RNA原位检测技术,RNAscope为**的ACD检测产品为在FFPE、冰冻切片中检测各种RNA,包括mRNA、lncRNA、点突变、外显子跳跃等提供了高效的解决方案。由于采用了有别于传统RNA原位杂交技术的专利的探针设计,以及信号级联放大系统,ACD的RNAscope, Basescope, miRNAscope技术克服了由于RNA易遭受环境中随处存在的RNase降解导致的高信噪比,低敏感度的困难,从而解决了RNA原位检测的**问题。

随着该项技术在国内的**推广,干细胞和发育领域,**及相关领域,传染病微生物研究领域等都在使用该项技术进行对应的研究。然而,骨及软骨样本由于其本身的特殊性,在国内进行RNA原位检测的应用相对较少。纵观国外相关文献,使用RNAscope技术在骨骼或软骨样本中进行RNA原位研究还是很常见。例如在发育类的研究中,2017年发表在J Clin Invest上的文章中[1],有学者使用RNAscope 技术研究了Rnf146条件性敲除前后颅骨和牙齿发育过程中,Noggin和Shh mRNA的分布情况(见下图,箭头所指棕色信号点为RNAscope在颅骨和牙齿中检测到的RNA信号)。


那么对于骨和软骨样本要做如何处理,才能够适用于RNA原位检测呢?以下是结合近期国内客户的部分结果,分享给大家的一些样本处理上的小贴士。


1. 骨和软骨样本固定:

对于骨和软骨样本,及时充分的固定是进行RNA原位检测的关键步骤。骨样本或者软骨样本取下后,**时间进行充分固定,可以很好的保护样本内的RNA。固定充分时RNA和蛋白很好的交联在一起,可以防止被过度降解。一般对于骨和软骨样本,建议使用中性福尔马林固定液(10%,NBF)在约20 倍骨体积下固定24-48小时。

2. 骨和软骨样本脱钙:

由于骨和软骨样本本身存在钙成分,故脱钙是进行后期蜡块制备,切片的必要步骤。为了适用于RNA原位检测,选取合适的脱钙液十分重要。ACD公司的脱钙液以及国内某公司的一款快速脱钙液(Preserve脱钙液)已经被证实可以在很好的脱钙的同时保存骨样本内的RNA,以达到后期RNA原位检测的目的。两种脱钙液的区别在于前者温和但耗时较长(数周);后者脱钙效力较强,时间较短(通常24小时内)。两种脱钙后的骨和软骨经验证RNA都能得到很好的保存。

脱钙时同样需要使用20倍组织体积的脱钙液,根据说明书推荐时间进行孵育。脱钙是否完全以使用镊子可以弯曲样本为标准。

注意:市面上的脱钙液种类较多,目前经客户反馈的一些其他种类的脱钙液使用后RNA保存效果不佳,故选择脱钙液时要谨慎。

3. 脱钙后步骤:

脱钙结束后要使用清水彻底冲洗样本约10分钟。之后如果制备石蜡块,则样本可以直接进入酒精脱水步骤。

如果制备冰冻样本,建议样本放入PBS浸泡1-2小时,之后放入4摄氏度的15%和30%蔗糖溶液直至样本沉入底部(该步操作可以有效保护组织形态)。之后取出样本用吸水纸蘸干外部水分后OCT包埋。

4. 结果例图

下图为国内客户提供的骨(左图)和软骨(右图)RNAscope检测结果例图。图中红色信号点为使用RNAscope 2.5 HD Red检测试剂盒检测的小鼠骨或软骨组织内Mm-Ppib的RNA信号(福尔马林固定24小时,Preserve脱钙液22小时处理的石蜡切片)。

RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品,在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比,RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术,其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端,配以自身级联放大检测原理,可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下:

01

应用**

使用RNAscope技术,靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列,即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种,所有组织以及所有基因的检测。

02

特异性强

RNAscope独特的双Z(ZZ) 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合,同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点,并会在杂交过程中被洗脱掉,从而防止非特异性信号的放大,使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。

03

灵敏度高

RNAscope方法检测每个RNA 分子时,只需三对双Z(ZZ)探针即可完成杂交和信号的可视化。

04

单分子可视化和单细胞定量:

使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。

05

兼容降解的RNA

由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA,而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针,因而即使目标RNA发生部分降解,仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。

06

检测结果稳定一致性

RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成,且该技术针对不同样本类型(冰冻切片, 石蜡切片,悬浮细胞,贴壁细胞等)已经有成熟的实验操作流程,故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外,该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行,为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

07

多通道多靶点同时检测

由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大,故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点;而在荧光检测过程中,可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。


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